Вирусные частицы вследствие малых размеров почти прозрачны для электронов и слабо их рассеивают, для того чтобы изображение вирионов было четко видимым, используются контрастирование вирусных препаратов при их приготовлении - напыление металлом (хром, вольфрам, золото, платина и др.) или так называемое негативное контрастирование с помощью химических соединений (фосфорновольфрамовая кислота - ФВК, вольфрамат натрия, молибденово-кислый аммоний и др.).
При диагностике фитовирусов необходимо определить форму и размер вирионов, для чего следует, как показали исследования ряда авторов, измерить не менее 100 вирусных частиц. Распределяя затем размеры вирионов по классам, определяют величину, наиболее часто встречающуюся, которую принимают за типичные размеры исследуемого вируса.
При приготовлении вирусных препаратов в качестве предметных стекол, на которые обычно помещают объект исследования, используются специальные сетки диаметром 2-3 мм (в зависимости от типа микроскопа), покрытые пленкой-подложкой из коллодия или фор- мвара, препараты готовят методами погружения, разбавленной суспензии, приготовления препаратов лабильных вирусов.
Для повышения чувствительности микроскопии при низкой концентрации вирионов применяют метод иммуноэлектронной микроскопии. Иммуномикроскопический метод применяется в трех вариантах: исследуют образцы, приготовленные из смеси вирус-антисыворотки; препарат с адсорбированными на плёнке подложки вирусными частицами, а затем обработанные антисывороткой; сеточки обрабатывают антисывороткой, а затем их помещают на вирусную суспензию сока растений для связывания с антителами.
Для электронной микроскопии лабильных вирусов и фитоплазм ткани растения с симптомами предварительно фиксируют в смолах, а в электронном микроскопе смотрят окрашенные ультратонкие срезы этих тканей. Этот метод также позволяет определить смешанную инфекцию фитоплазм, спироплазм, других бактерий и вирусов, что является необходимым при отсутствии возможности применения иммунного или генетического мультиплексных анализов.
Если развитие мицелия слабое, то для выявления и определения возбудителя применяется закладка растений или их частей во «влажные камеры» для интенсификации прорастания мицелия и определения патогена по характерным морфологическим признакам. Бывает, что патогены находятся в растительном организме в скрытой форме или дают сходные симптомы поражения, развивают однотипный мицелий, в таких случаях применяются инструментальные серологические или молекулярные методы, дополненные выделением подозреваемого возбудителя в чистую культуру, и подтверждение патогенности исследуемых микроорганизмов правилами Роберта Коха (Триада Коха) [43, 66, 68, 78].
Использование данных методов позволяет разрабатывать для практического использования системы надзора за болезнями. В Центральном Сибирском ботаническом саду СО РАН и Новосибирском ГАУ исследовали в условиях необогреваемой пленочной теплицы на юге Западной Сибири состав возбудителей и степень поражения болезнями прорастающих семян, растений коллекции вигны из ВНИИ имени Н.И. Вавилова и биоресурсной научной коллекции ЦСБС СО РАН УНУ № USU 440534, включающей в себя 87 сортообразцов. Зараженность семян определяли по ГОСТ 12044-93 методами микологического анализа на универсальных питательных средах Чапека и КДА и «влажной камеры». Этиологию пятнистостей и гнилей устанавливали методами прямого микроскопирования и «влажной камеры» [79]. В резльтате были сформированы методические рекомендации по защите растения от болезней на основе фенологии.
Источник: Методы диагностики возбудителей заболеваний овощных культур: аналит. обзор. –М.: ФГБНУ «Росинформагротех», 2020. – страница 59-61
